來(lái)源：以(yǐ)下文章來(lái)源于(yú)Cytiva思拓凡 ，作者Li Yafei

2023年2月25日，中華中醫藥學會發布了(le／liǎo)2022年中醫藥十大(dà)學術進展。張伯禮院士指出(chū)：2022年度中醫藥十大(dà)學術進展主要(yào / yāo)呈現的(de)價值，就(jiù)包括“重視新技術新方法在(zài)中醫藥中的(de)應用”。北京大(dà)學醫學部曾克武教授和(hé / huò)屠鵬飛教授與浙江大(dà)學、大(dà)連醫科大(dà)學、博奧生物研究團隊憑借“新技術助力中藥功效科學内涵闡釋”共同獲選2022年度中醫藥十大(dà)學術進展。

中醫藥研究者中有廣泛的(de)Biacore用戶基礎，曾克武教授和(hé / huò)屠鵬飛教授團隊的(de)這(zhè)一(yī / yì ／yí)成果裏自然也(yě)有Biacore的(de)身影。接下來(lái)就(jiù)讓小編帶您領略Biacore這(zhè)一(yī / yì ／yí)現代科技，如何與傳統中醫藥碰撞并融合，從而(ér)闡釋中藥功效科學的(de)内涵。

天然産物中抗腫瘤活性分子(zǐ)

發現及作用機制揭示1

腫瘤免疫微環境（Tumor immune microenvironment ，TIME）調控因子(zǐ)IGF2BP1是(shì)一(yī / yì ／yí)種關鍵N6 -甲基腺苷 (m6A) 閱讀蛋白，識别m6A靶點轉錄物，被認爲(wéi / wèi)是(shì)腫瘤治療的(de)潛在(zài)靶點。2022年曾克武教授和(hé / huò)屠鵬飛教授團隊發表的(de)研究成果中，發現了(le／liǎo)天然産物葫蘆素B通過結合IGF2BP1發揮抗腫瘤作用，并且闡釋了(le／liǎo)作用機制。

以(yǐ)IGF2BP1爲(wéi / wèi)出(chū)發點，作者首先發現，在(zài)小鼠H22荷瘤模型中敲低IGF2BP1，可以(yǐ)通過免疫細胞招募和(hé / huò)降低TIME中PD-L1的(de)表達來(lái)抑制肝細胞癌的(de)進展。使用Biacore 8K，作者驗證了(le／liǎo)IGF2BP1與甲基化單鏈RNA（ss-m6A）的(de)強親和(hé / huò)力，達到(dào)了(le／liǎo)18.3 nM。并且發現，IGF2BP1與非甲基化RNA（ss-A）的(de)親和(hé / huò)力則低了(le／liǎo)13倍。

确定了(le／liǎo)治療靶點之(zhī)後，作者使用Biacore 8K，直接從包含889種化合物的(de)中藥天然産物庫中篩選能抑制IGF2BP1與其m6A靶點的(de)活性分子(zǐ)。通過合成生物素标記的(de)ss-m6A，作者将RNA直接固定在(zài)芯片上(shàng)，将化合物固定濃度（20 μM）與IGF2BP1預孵育，檢測RNA與化合物- IGF2BP1的(de)結合信号，從而(ér)直接篩選出(chū)具有抑制效果的(de)天然産物（圖1）。

圖1：Biacore 8K抑制劑篩選方法示意圖

通過Biacore 8K的(de)高通量抑制劑篩選實驗，作者得到(dào)了(le／liǎo)抑制劑篩選的(de)排序。從圖2中可以(yǐ)直觀看出(chū)，六種具有較強抑制效果的(de)天然産物被發現，其中抑制效果最強的(de)當屬葫蘆素B（CuB）。在(zài)Huh增殖抑制實驗中，葫蘆素B同樣表現出(chū)了(le／liǎo)抑制作用，72h時(shí)的(de)IC50達到(dào)1.0 uM。

圖2：Biacore 8K抑制劑篩選結果

高通量篩選+精确表征，在(zài)藥物研究的(de)各個(gè)階段都少不(bù)了(le／liǎo)Biacore。在(zài)篩選得到(dào)葫蘆素B後，作者當然同樣使用Biacore精确表征了(le／liǎo)IGF2BP1與葫蘆素B的(de)親和(hé / huò)力。結果發現，二者的(de)親和(hé / huò)力達到(dào)了(le／liǎo)1.2 μM，與細胞實驗相互印證（圖3）。

圖3：Biacore精确表征IGF2BP1與CuB的(de)親和(hé / huò)力

葫蘆素B又是(shì)什麽呢？

葫蘆素B是(shì)從葫蘆科等植物中分離得到(dào)的(de)一(yī / yì ／yí)類四環三萜類化合物，具有廣泛的(de)藥理活性。以(yǐ)葫蘆素B爲(wéi / wèi)主要(yào / yāo)成分的(de)葫蘆素制劑在(zài)臨床治療濕熱毒盛所緻的(de)遷延性肝炎、肝硬化和(hé / huò)原發性肝癌具有确切療效。中藥研究，除了(le／liǎo)根據已知靶點從天然産物庫中找活性分子(zǐ)外，另一(yī / yì ／yí)個(gè)角度則是(shì)已知活性分子(zǐ)，尋找作用靶點。在(zài)通過抑制劑篩選及表征，從靶點IGF2BP1出(chū)發找到(dào)活性分子(zǐ)葫蘆素B後，作者使用“鈎釣”的(de)方法，驗證是(shì)否能利用葫蘆素B“鈎”出(chū)靶點IGF2BP1。

作者首先合成了(le／liǎo)葫蘆素B分子(zǐ)探針，然後利用pull-down + 質譜的(de)方法從Huh細胞裂解液中成功“鈎”到(dào)了(le／liǎo)靶點IGF2BP1，并且在(zài)免疫熒光共定位實驗中證明了(le／liǎo)細胞中葫蘆素B與IGF2BP1的(de)結合。至此，不(bù)論是(shì)從靶點出(chū)發找活性分子(zǐ)，還是(shì)從活性分子(zǐ)出(chū)發找靶點，雙管齊下，作者明确了(le／liǎo)葫蘆素B與腫瘤免疫微環境調控因子(zǐ)IGF2BP1的(de)直接結合。

爲(wéi / wèi)了(le／liǎo)進一(yī / yì ／yí)步闡釋葫蘆素B的(de)抗腫瘤機制，作者研究了(le／liǎo)IGF2BP1上(shàng)葫蘆素B的(de)結合位置及結合方式。将IGF2BP1的(de)結構域逐一(yī / yì ／yí)删除後，作者發現隻有缺失了(le／liǎo)C端KH結構域會使IGF2BP1與葫蘆素B不(bù)能結合。通過質譜、pull-down、BLAST、CD等多種方法，作者最終确定，葫蘆素B通過邁克爾加成反應結合在(zài)IGF2BP1中KH1−2結構域的(de)Cys253上(shàng)，并且會引起IGF2BP1的(de)構象變化。

那麽葫蘆素B又是(shì)如何影響IGF2BP1的(de)功能呢？

IGF2BP1本身會與ss-m6A結合，前面作者使用Biacore做了(le／liǎo)二者抑制劑的(de)高通量篩選，得到(dào)了(le／liǎo)葫蘆素B。高通量抑制劑篩選能做，單獨的(de)抑制劑表征當然手到(dào)擒來(lái)。作者設置了(le／liǎo)Biacore實驗來(lái)從生化角度上(shàng)表征葫蘆素B的(de)抑制效果。從結果可以(yǐ)看出(chū)，随着葫蘆素B的(de)濃度逐漸提高，IGF2BP1與ss-m6A的(de)結合信号越來(lái)越低（圖4）。Biacore結果與RNA pull-down實驗一(yī / yì ／yí)緻，明确了(le／liǎo)葫蘆素B可以(yǐ)抑制二者結合。

圖4：Biacore實驗明确葫蘆素B抑制IGF2BP1與ss m6A的(de)結合

後續作者還發現，葫蘆素B可以(yǐ)降低與IGF2BP1所結合的(de)mRNA（包括c-MYC、KRAS 等mRNAs）穩定性，在(zài)體内通過誘導細胞凋亡，招募免疫細胞到(dào)腫瘤微環境，阻斷PD-L1的(de)表達，最終表現出(chū)明顯的(de)抗腫瘤效果（圖5）。

圖5：文章主要(yào / yāo)研究路線及作用機制概述

曾克武教授和(hé / huò)屠鵬飛教授團隊專注于(yú)天然活性分子(zǐ)治療各類型重大(dà)疾病的(de)發現及機制闡釋，開發了(le／liǎo)包括分子(zǐ)探針、蛋白芯片2在(zài)内的(de)多種靶點“鈎釣”技術，多年以(yǐ)來(lái)，許多研究成果中均使用了(le／liǎo)Biacore作爲(wéi / wèi)生物分子(zǐ)相互作用檢測技術。中國(guó)科學院院士陳凱先教授指出(chū)：年度的(de)學術進展是(shì)中醫藥學術研究的(de)“指南針”和(hé / huò)“風向标”。相信此次研究成果的(de)入選，也(yě)将爲(wéi / wèi)廣大(dà)中醫藥研究者提供更多研究思路，對“積極推進中醫藥科研和(hé / huò)創新，推動傳統中醫藥和(hé / huò)現代科學結合”有重要(yào / yāo)意義。

Biacore

作爲(wéi / wèi)現代化的(de)體外分子(zǐ)互作“金标準”，以(yǐ)其超高的(de)靈敏度，超高的(de)數據質量，無分子(zǐ)量檢測下限，适用于(yú)各類型的(de)天然産物及生物分子(zǐ)研究，在(zài)中醫藥研究者中有廣泛的(de)用戶基礎。Biacore将持續與廣大(dà)中醫藥研究者勠力同心，共同推動中醫藥的(de)現代化研究和(hé / huò)應用。

Biacore，for a better life

參考文獻：

[1] Liu Y ,  Guo Q ,  Yang H , et al. Allosteric Regulation of IGF2BP1 as a Novel Strategy for the Activation of Tumor Immune Microenvironment[J].  2022.

[2] Zhang et al. Neuroinflammation inhibition by small-molecule targeting USP7 noncatalytic domain for neurodegenerative disease therapy, Sci. Adv. 8, eabo0789 (2022)